去泛素化酶Ataxin-3在胃癌中的表达及作用地位的研究
【摘要】研究背景胃癌（Gastriccancer，GC）是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤之一。我国是胃癌的高发地区，每年因胃癌死亡人数占到所有因癌症死亡人数的23.2%。进展期胃癌患者的预后较差、术后的5年生存率不超过30%。对进展期胃癌的多靶点的联合用药治疗成为人类抗击胃癌的重要新策略。由于恶性肿瘤发病的分子机制复杂而多样，目前关于胃癌发病的分子机制依然不是很清楚，所以有效的治疗靶点的认定仍面临巨大挑战，大量的研究仍有待进一步进行。泛素蛋白酶体系统（UPS）是机体内主要的蛋白质降解和质控的方式之一。它通过对变性、错误折叠、异常聚集及翻译后损坏蛋白的降解发挥重要的细胞定量控制作用。在某些情况下，异常蛋白超过了UPS的降解能力，导致泛素化异常蛋白的积聚，最终可导致细胞的功能障碍、死亡及包括恶性肿瘤在内的重大疾病的发生。去泛素化酶DUB是UPS中重要的一环，其可识别泛素、底物蛋白或蛋白酶体的特异序列，发挥特异性的去泛素化作用。涉及调控恶性肿瘤细胞功能的主要表现在以下几个方面：1）细胞信号通路的调控。2）与细胞的生存及细胞周期相关的调控。3）参与转录的调控。泛素化与去泛素化的改变与多种肿瘤的发生密切相关。Ataxin-3作为一种去泛素化酶，与目前发现的与肿瘤发生发展有关DUBs功能上存在许多相似之处，故其在恶性肿瘤发生、发展中的作用值得进一步研究。Ataxin-3是一个多聚谷氨酰胺蛋白（polyglutamine,polyQ），是一种重要的去泛素化酶（Deubiquitinatingenzyme，DUB）。最初被认为是脊髓小脑型共济失调/马查多-约瑟夫病III型（spinocerebellarataxintype3andMachado-Josephdisease,SCA3/MJD）发病的核心病因。Ataxin-3蛋白由ATXN3（MJD）基因编码，广泛表达于全身各组织；ATXN3基因位于人的14q21。目前报道的人Ataxin-3蛋白有12种转录亚型，其中最长的亚型约有376个氨基酸残基，分子量约为42kDa。Ataxin-3蛋白包含了一个球状的、有去泛素化功能的N-末端Josephindomain(JD)结构域；其C-末端尾部具有2~3个可与泛素结合的基本模式UIM（ubiquitin-interactingmotifs）结构和多聚谷氨酰胺蛋白polyQ区域。其主要功能包括以下1）可与泛素、多聚泛素链、泛素样蛋白（如Nedd8）及泛素化蛋白作用。2）具有DUB活性，有编辑多聚泛素链的功能。3）可与蛋白酶体的亚基作用。4）与VCP/p97等复合分子相互作用。涉及的主要细胞和生化的过程包括：去泛素化活性影响蛋白质的降解、转录的调控、细胞的凋亡及死亡通路的调控、某些组织细胞的分化发育及细胞骨架的形成等方面。作为一种去泛素化酶，其存在许多和目前研究发现的与恶性肿瘤发生、发展密切相关的DUBs相似之处。目前有关Ataxin-3的研究是很有限的；在细胞的恶性转化及肿瘤的发生发展中的地位和作用鲜见报道。新近应用DUBs的siRNA筛选技术，在非小细胞肺癌中研究发现Ataxin-3是调控PTEN信号通路效果最强的DUBs之一；在ANTX3基因功能缺陷的情况下，A549细胞中PTEN的转录增强，足够下调Akt的磷酸化及PI3K通路的活化，使细胞的生存活性下降。p53基因是至今为止发现的与人类多种肿瘤相关性最高的基因之一，正常和突变的Ataxin-3皆有使p53转录活性增强的作用。CHIP（Hsc70羧基端结合蛋白，C-terminalheatshockprotein70-interactingprotein），又名STUB1或STIP1是一种重要的分子伴侣依赖的泛素连接酶E3，参与扩展突变Ataxin-3和p53蛋白的UPP降解；而Ataxin-3可通过限制泛素化链的长度，参与CHIP泛素化循环的始末并发挥调控作用。而胃癌组织中是否有差异性表达的Ataxin-3？Ataxin-3是否参与胃癌细胞的生长和凋亡失调控的过程？类似于与Ataxin-3相互作用的CHIP及p53的网络关系是否存在于胃癌中？皆未见研究报道。目前尚未见有确切的研究资料表明Ataxin-3在胃癌中的表达及作用。本研究拟探讨Ataxin-3在胃癌中的表达，并对其相关功能和机制行初步探索。本研究内容包括以下三部分：第一部分Ataxin-3在胃癌中的表达及意义目的:检测Ataxin-3蛋白在胃癌组织、癌旁对应上皮内瘤变组织及对照胃黏膜组织中的表达，分析与胃癌患者的临床病理学资料的关系，并进行单因素和多因素分析；检测Ataxin-3的mRNA在胃癌组织及对照黏膜组织中的表达，分析胃癌组织中，Ataxin-3是否在转录水平上存在差异性表达；检测人胃黏膜上皮细胞（GES-1）、来源于中分化胃癌细胞（SGC7901）及来源于低分化胃癌细胞(MKN45）的Ataxin-3蛋白和mRNA的表达，进一步分析Ataxin-3在胃癌中的差异表达。探讨Ataxin-3在胃癌发生、发展过程中的意义，通过本研究的实施为确立Ataxin-3在胃癌中的作用及地位提供一定的实验依据。方法:1.应用免疫组织化学方法检测Ataxin-3蛋白在胃癌组织（536例）、癌旁对应上皮内瘤变组织（低级别86例、高级别75例）及对照胃黏膜组织（312例）中的表达，并结合胃癌患者的临床病理学特征，分析其与胃癌上皮内瘤变的关系，与胃癌的临床病理学特征之间的相关性，并进行单因素和多因素分析。2.应用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)的方法检测Ataxin-3的mRNA在胃癌组织（14例）及对照胃黏膜组织（14例）中的表达，分析胃癌组织中，Ataxin-3是否在转录水平上存在差异性表达。3.应用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)和蛋白的免疫印迹（Westernblot，WB）检测人胃黏膜上皮细胞（GES-1）、来源于中分化胃癌细胞（SGC7901）及来源于低分化胃癌细胞(MKN45）中Ataxin-3的mRNA和蛋白的表达，进一步分析Ataxin-3在胃癌中的差异表达。结果：1.免疫组化检测结果显示，所有312例对照胃黏膜组织中Ataxin-3蛋白100%表达；低级别上皮内瘤变（86例）、高级别上皮内瘤变（75例）和胃癌（536例）三组中Ataxin-3的阳性率分别为58.1%、88%和72.76%。各组的表达强度比较，胃癌组与高级别上皮内瘤变组比较无差异（P＞0.05），其余各组间两两相比均有显著性差异（P＜0.001）。2.Ataxin-3的蛋白表达与肿瘤的大小，Lauren的组织学分型，组织学分化及突变p53蛋白的表达有关(P＜0.05)，等级相关系数分别为：-0.087（P＜0.05）、-0.384（P＜0.000）、-0.230（P＜0.000）及+0.108（P＜0.05）。而与年龄，性别，肿瘤的部位，Bormann分型，浸润深度，淋巴结转移，远处转移及TNM临床分期无关(P＞0.05）。3.536例患者中位生存期32.73个月，术后1、3、5年累积生存率为71%、46%、33%。4.单因素分析结果显示：肿瘤的部位、大小、Lauren组织学分型、浸润的深度、区域淋巴结转移的数目、肿瘤的远处转移、TNM分期及突变p53蛋白表达与5年生存率有关（P＜0.05）。而年龄、大体类型、性别、组织学分化、癌栓、Ataxin-3蛋白表达、吸烟及饮酒史暂未发现与预后有关（P＞0.05）。5.多因素分析表明肿瘤的部位，Lauren的组织学分型，组织学分化，TNM的临床分期和突变p53蛋白的表达是独立的胃癌的预后因素（P＜0.05）；未提示年龄，性别，肿瘤的大小，Bormann分型，吸烟和饮酒是有独立的预后意义（P＞0.05）。6.荧光定量PCR检测GC的Ataxin-3mRNA表达，结果提示Ataxin-3mRNA在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达均低于对照的胃黏膜组织及细胞株（P＜0.05）；MKN45表达最低。7.WBt检测人GC细胞和对照胃黏膜上皮细胞，结果提示Ataxin-3蛋白在GES-1中表达最高，其余依次为SGC7901，MKN45表达最少。结论：1.Ataxin-3表达下调与胃癌特别是弥漫型胃癌发生和肿瘤细胞低分化状态等关系密切，提示其很可能是在胃癌发生、发展过程中有重要意义的分子。2.未能发现Ataxin-3与胃癌患者的预后有直接的相关性，推测它可能是起协同作用。Ataxin-3有望成为胃癌多靶点治疗的候选因子。第二部分Ataxin-3在胃癌细胞中的功能学研究目的：pLV-EF1a-EGFP-2A载体质粒转染SGC7901细胞，检测Ataxin-3过表达对SGC7901细胞的生长和凋亡，对p53、p21、Bax的mRNA表达，及对CHIP蛋白表达的影响。进一步从细胞功能学角度认证Ataxin-3在胃癌中可能的作用机制。方法：采用LV-EF1a-EGFP-2A-ATXN3及空转载体,瞬时转染SGC7901细胞，设立空白对照组（SGC7901）；ATXN3过表达组；空载质粒组。通过CCK8法检测细胞的增殖，流式细胞术检测细胞的凋亡；荧光定量PCR检测细胞生长周期及凋亡相关因子如，p53、p21、Bax等mRNA表达；WB检测CHIP的蛋白表达。结果：1.ATXN3过表达的SGC7901细胞出现明显的生长抑制。2.流式细胞仪检测显示，ATXN3过表达组凋亡率明显增加。3.ATXN3过表达组与空白对照组（SGC7901）、空载质粒组相比均有p53的mRNA表达较低，Bax的mRNA表达较高（P＜0.05）；而p21的mRNA表达无差异（P＞0.05）。4.WB检测显示过表达组的Ataxin-3明显增高而其的CHIP蛋白表达下调。结论：过表达的Ataxin-3可通过抑制胃癌细胞的生长，促进细胞的凋亡及影响CHIP的表达等机制参与胃癌的发生、发展；为Ataxin-3成为胃癌治疗的候选靶点提供实验依据。第三部分ATXN3-EGFP/SGC7901细胞模型的构建目的：为了进一步探讨Ataxin-3在胃癌中的功能及作用机制，我们构建携带ATXN3基因的慢病毒真核过表达载体，利用慢病毒载体系统将ATXN3转染至SGC7901细胞，建立稳定过表达Ataxin-3的SGC7901细胞模型（即ATXN3-EGFP/SGC7901），为后续的生物学研究提供稳定转染细胞株的实验平台。方法：将ATXN3基因全长cDNA克隆至慢病毒过表达载体pLV-EF1a-EGFP-2A,构建可同时独立表达GFP蛋白和ATXN3蛋白的慢病毒载体；采用感受态细菌完成质粒的克隆性扩增及抽提利用，对质粒的目的基因测序鉴定；之后在293T细胞完成慢病毒颗粒包装，并转染SGC7901细胞，流式荧光分选出稳定转染的SGC7901细胞，用WB检测稳转株中的ATXN3基因的蛋白表达。结果：1.经测序验证插入质粒的目的基因(ATXN3)序列正确。2.质粒慢病毒系统由载体质粒pLV-EF1a-EGFP-2A、包膜质粒PL1,PL2及包装质粒pMD2.G组成，并在293T细胞中完成包装。3.LV载体转染SGC7901细胞，转染后的细胞内可以观察到绿色荧光（由GFP蛋白发出）；流式荧光分选稳定转染的SGC7901细胞，荧光分选率高于50%，筛选出可稳定过表达Ataxin-3的pLV-ATXN3-EGFP/SGC7901胃癌细胞；经WB检测显示ATXN3-EGFP/SGC7901组的Ataxin-3蛋白高表达。结论：成功构建了体外Ataxin-3过表达载体，实现了稳定转染后胃癌细胞SGC7901中Ataxin-3蛋白的高表达。为我们深入研究Ataxin-3对胃癌细胞生物学特性的影响提供细胞模型。
【作者】曾丽霞；
【导师】马韵；
【作者基本信息】广西医科大学，病理与病理生理学，2014，博士
【关键词】胃癌；Ataxin-3；p53；Hsc70羧基端结合蛋白；免疫组化；实时荧光定量PCR；免疫印迹；人胃癌细胞SGC7901；MKN45；质粒；过表达；转染；
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